orimabs技術(shù)領(lǐng)域

重組蛋白制備
 

為了產(chǎn)生抗體，一步是制備重組抗原蛋白。我們擁有用于重組蛋白表達(dá)的三個(gè)表達(dá)平臺(tái)，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞（CHO和HEK293無血清系統(tǒng)），酵母和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。

對于人類抗原，哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)是理想的表達(dá)系統(tǒng)，因?yàn)槠渲卣郫B和翻譯后修飾（例如糖基化）接近天然抗原。在大多數(shù)情況下，細(xì)胞表面抗原的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域（例如腫瘤標(biāo)志物）是抗體生成的目標(biāo)域。需要制備細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的重組蛋白，而不是完整的表面蛋白（包括單個(gè)或多個(gè)跨膜和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域）。然而，部分地由于其天然易位方式的改變而僅表達(dá)天然蛋白的一部分是非常具有挑戰(zhàn)性的。為了克服這個(gè)問題，我們開發(fā)了幾種新穎的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，它們能夠使這種困難表達(dá)蛋白高水平表達(dá)。
 

抗原高表達(dá)細(xì)胞系的建立
 

有時(shí)為了確保用于文庫篩選的抗原處于其天然構(gòu)象，我們使用抗原陰性和陽性細(xì)胞系來篩選文庫。我們有一個(gè)慢病毒表達(dá)系統(tǒng)來創(chuàng)建抗原高表達(dá)細(xì)胞系。抗原的高表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)EGFP的表達(dá)有關(guān)，因此可以通過熒光激活細(xì)胞分選術(shù)（FACS）純化高表達(dá)的細(xì)胞。

酵母菌展示

酵母展示是一種用于抗體發(fā)現(xiàn)的新開發(fā)技術(shù)。與噬菌體展示相比，酵母展示具有以下優(yōu)勢：真核表達(dá)，利用FACS分選來選擇性分離不同親和水平群體的能力以及方便地通過FACS檢測抗原結(jié)合，這使得酵母展示成為發(fā)現(xiàn)新抗體的有力工具。

然而，很大程度上由于酵母轉(zhuǎn)化效率低而構(gòu)建大的酵母展示抗體文庫是非常具有挑戰(zhàn)性的。我們開發(fā)了一種技術(shù)，可使酵母轉(zhuǎn)化效率比傳統(tǒng)方法提高1000倍，從而有可能有效地構(gòu)建大型酵母展示抗體庫。

除了優(yōu)化酵母轉(zhuǎn)化效率外，我們還開發(fā)了新穎的酵母展示載體，可以在單體或二聚體中展示scFv，具有*的標(biāo)簽和接頭，可有效克隆，展示，檢測和保護(hù)scFv的結(jié)構(gòu)和功能不受影響由共表達(dá)的AGA2蛋白和標(biāo)簽組成（圖1）。 

如果將分離的scFv的終目標(biāo)工程化為二聚體，例如scFv-Fv或完整抗體，則建議使用二聚體scFv庫，因?yàn)楦哂H和力單體scFv可能不會(huì)轉(zhuǎn)化為高親和力的二聚體。如果scFv是終的抗體形式，例如標(biāo)記納米顆粒或開發(fā)基于scFv的成像探針，則建議將單體scFv顯示庫用于scFv分離。有時(shí)抗原只有很小的口袋抗原決定簇，這很可能在小肽抗原中觀察到，全尺寸的scFv太大而無法適合小的口袋抗原決定簇，一個(gè)僅包含VH或VL的單結(jié)構(gòu)域文庫將是理想的屏幕。

我們還開發(fā)了一種使用重組蛋白，標(biāo)簽融合蛋白或基于細(xì)胞的篩選的綜合文庫篩選策略（圖1）。從文庫分離的scFv親和力通常在單體的納摩爾范圍內(nèi)，并且當(dāng)被工程化以進(jìn)行調(diào)光時(shí)，例如scFv-Fc或完整抗體，親和力通常將增加約10倍。
 

插圖1：酵母顯示的二聚體和單體scFv。

圖1：基于細(xì)胞的酵母展示抗體文庫淘選。

噬菌體展示

酵母展示對于Fab文庫的構(gòu)建是具有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)楹茈y以適當(dāng)?shù)谋嚷释瑫r(shí)表達(dá)VH和VL / VK兩者以使VH和VL / VK之間100％偶聯(lián)。因此，我們的Fab文庫是使用噬菌體展示構(gòu)建的。OriMAbs已開發(fā)出用于Fab庫構(gòu)建的噬菌體展示系統(tǒng)。兩組噬菌粒，pDCK1和pDCK1.1；以及pDCL1和pDCL1.1分別設(shè)計(jì)用于κ和λ鏈Fab展示。兩種載體均具有IgG1 CH1恒定區(qū)，并且所有恒定區(qū)均已針對大腸桿菌進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。表達(dá)和所有酶被設(shè)計(jì)為方便消化和有效克隆。噬菌粒pDCK1和pDCL1也可以用于scFv展示，其中，接頭中的酶位點(diǎn)也被優(yōu)化以確保翻譯的接頭對于VH和VL之間的有效偶聯(lián)是靈活的。

酵母展示人類天真的調(diào)光器-scFv庫

使用*的技術(shù)和新穎的展示載體pYDS2（展示調(diào)節(jié)劑scFvs），OriMAbs從B淋巴細(xì)胞中分離出了1x1011酵母展示調(diào)節(jié)劑scFv庫，該B淋巴細(xì)胞來自于56例健康供體的5升外周血?？偣卜蛛x出6.9 mg總RNA，并從中純化了125.3 mg mRNA，并使用能夠挽救所有人類抗體庫的新型引物用于逆轉(zhuǎn)錄和VH，VK和VL擴(kuò)增。ScFv在釀酒酵母上以較暗的方式顯示EBY100通過AGA1和AGA2之間的相互作用使細(xì)胞表面應(yīng)變。在測序的24個(gè)克隆中，所有克隆均包含scFv基因，其中83.3％具有單個(gè)scFv基因，16.7％具有2個(gè)scFv基因。Flag標(biāo)簽在100％克隆中表達(dá)，而V5標(biāo)簽在83.3％（20/24）克隆中表達(dá)（圖2）。V5標(biāo)簽表達(dá)失敗是由于scFv基因發(fā)生移碼突變，可能是種系中編碼截短抗體或PCR引入的真實(shí)序列（3/24）或構(gòu)象障礙（1/24）。通過磁選和流選與該文庫隔離（圖3）。建議將該庫用于scFv發(fā)現(xiàn)，以便將scFv工程化為二聚體，例如scFv-Fc或完整抗體。
 

圖2：在24個(gè)酵母克隆中的V5表達(dá)顯示了人類天然的scFv文庫。紅色：陰性對照；藍(lán)色：V5標(biāo)簽表達(dá)

圖3：在24個(gè)酵母克隆中的標(biāo)志表達(dá)顯示了人類天然的scFv文庫。紅色：陰性對照；藍(lán)色：標(biāo)志標(biāo)記表達(dá)

酵母展示人類天真單體-scFv庫

還使用不同的酵母展示載體pYDS1和相同的VH，VK和VL基因構(gòu)建了酵母展示的人類天然單體scFv庫，用于二聚體-scFv庫的構(gòu)建。庫大小為1.2×10 ^ 11。建議將該庫用于scFv發(fā)現(xiàn)，因?yàn)閟cFv將是應(yīng)用程序的終格式。

酵母展示人類天真的單域庫

還使用酵母展示載體pYDS1和相同的VH，VK和VL基因構(gòu)建了酵母展示人類樸素單域文庫，用于單體或二聚體-scFv文庫的構(gòu)建。庫大小為5×10 ^ 9。推薦該文庫用于發(fā)現(xiàn)只有小口袋表位的抗原的單域抗體。
 

噬菌體展示人類天然Fab庫

我們使用分離自56個(gè)健康供體的相同5 L外周血的VH和VL池，使用載體pDCK和pDCL（kappa：lambda = 2：1）構(gòu)建了2×1010 Fab噬菌體展示文庫。評(píng)估的12個(gè)克隆顯示100％VK / VL插入和91.6％（11/12）VH插入。
 

從酵母展示文庫中發(fā)現(xiàn)抗體

我們還開發(fā)了一種使用重組蛋白，標(biāo)簽融合蛋白或基于細(xì)胞的篩選的綜合文庫篩選策略（圖1）。庫平移包括2-3輪磁選，然后是2-3輪精細(xì)流選。排序的高親和力酵母展示群體可直接使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行個(gè)體克隆鑒定，或轉(zhuǎn)化為分泌型scFv亞庫，并使用高通量ELISA進(jìn)行個(gè)體克隆鑒定。鑒定出的scFv將被表達(dá)和純化以用于表征，例如親和力測量和插入分析，然后進(jìn)入下游工程流程。從文庫中分離出的scFv親和力在單體中通常處于納摩爾范圍內(nèi)（圖4），通常在經(jīng)過調(diào)光后，親和力會(huì)增加約10倍，
 

圖4：樣品scFvs a和b的親和力測量。

通過噬菌體庫淘選抗體

我們已經(jīng)開發(fā)了固相和液相的噬菌體展示文庫淘選。直接在固相（例如ELISA板或免疫管）上的抗原包被可能會(huì)使抗原構(gòu)象變形，結(jié)果可能丟失一些表位，從而降低分離的抗體的多樣性，或者分離的抗體可能根本不結(jié)合天然構(gòu)象抗原。為了克服這個(gè)潛在的問題，我們已經(jīng)開發(fā)液相淘選法，其中，無論是抗原和抗體在其天然構(gòu)象。抗原結(jié)合的噬菌體群體將通過磁選分離，分離的可溶性Fab抗體將在大腸桿菌中產(chǎn)生。
 

抗體工程

從抗體庫中分離的單結(jié)構(gòu)域抗體，scFv或Fab抗體通常需要進(jìn)行工程改造以用于不同的目的，例如，可以將它們改造為scFv-Fc或全抗體，以實(shí)現(xiàn)更高的親和力，更好的穩(wěn)定性和更長的循環(huán)時(shí)間。我們提供所有已知格式的抗體的設(shè)計(jì)和工程改造，例如scFv，二聚體scFv，F(xiàn)ab，F(xiàn)（ab'）2，單結(jié)構(gòu)域抗體，scFv-Fc和全抗體。

親和力成熟

通常，從我們的文庫中分離出的抗體具有納摩爾范圍的親和力，當(dāng)工程化為二聚體時(shí)，親和力將增加約10倍。因此，從我們的文庫生成的抗體通常不需要親和力成熟。如果需要更高的親和力，我們可以選擇通過酵母和噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行親和力成熟。

酵母展示的優(yōu)勢在于，可以使用熒光輔助細(xì)胞分選術(shù)（FACS）輕松對抗原結(jié)合的酵母菌群進(jìn)行分選，因?yàn)榻湍妇拇笮∽阋员籉ACS識(shí)別。這使酵母菌的展示比噬菌體在親和力成熟方面更有效，因?yàn)槌擞糜谑删w展示的抗原濃度管理和嚴(yán)格洗滌之外，F(xiàn)ACS在直接將高親和力酵母種群從其他培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化為高親和力酵母菌方面更有效（圖xx） 。

圖5：用于抗原結(jié)合的高親和力酵母群體的流式分選。

抗體生產(chǎn)

我們已經(jīng)開發(fā)了用于抗體表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)，包括用于以細(xì)胞內(nèi)或分泌形式表達(dá)單結(jié)構(gòu)域抗體，scFv和Fab的大腸桿菌系統(tǒng)；用于單結(jié)構(gòu)域抗體，scFv和Fab分泌表達(dá)的酵母系統(tǒng); 和用于所有片段抗體和全抗體的分泌表達(dá)的哺乳動(dòng)物系統(tǒng)。我們提供通過這些表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)和純化所有抗體形式的服務(wù)。
 

抗體藥物偶聯(lián)物

抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）是一種新興的抗體治療技術(shù)?？贵w（通常是全抗體）通過可裂解或不可裂解的連接子用超毒性藥物（例如MMAE，MMAF和DM1）標(biāo)記，以特異性地向抗原陽性細(xì)胞傳遞毒性。死細(xì)胞釋放的毒素（MMAE和DM1）也可以通過旁通機(jī)制進(jìn)入并殺死附近的抗原陽性細(xì)胞。我們提供與這些藥物結(jié)合的完整抗體和相關(guān)特性的服務(wù)。 
 

雙特異性抗體

雙特異性抗體（一個(gè)臂使用抗CD3抗體靶向T細(xì)胞，另一臂使用腫瘤特異性抗體靶向腫瘤細(xì)胞）充當(dāng)將T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞結(jié)合在一起并激活T細(xì)胞殺死腫瘤的橋梁。我們提供設(shè)計(jì)，構(gòu)建，表達(dá)和評(píng)估雙特異性抗體的服務(wù)。

光學(xué)成像的抗體標(biāo)記

光學(xué)成像是一種用于體內(nèi)抗體生物分布研究的方便且有用的方法，例如小鼠中的抗原表達(dá)譜研究，小鼠模型中的腫瘤靶向評(píng)估。由于近紅外（NIR）染料在組織中的深度滲透（大約1 cm），因此常用于這些研究。我們提供與這些染料和相關(guān)表征有效結(jié)合和純化片段抗體或完整抗體的服務(wù)。