ComplementTech C5說明書

名稱： C5蛋白

編號： A120

規(guī)格： 250 µg/vial

濃度： 1.0 mg/mL (實際濃度見分析證書)

類型 冷凍液體

活動： >值為80%，與正常人血清標(biāo)準(zhǔn)相比。

純度： >95%由SDS-PAGE

緩沖區(qū)： 10 mM磷酸鈉，145 mM氯化鈉，pH 7.2

消缺系數(shù)。 A280 nm在1.0 mg/mL時的=為1.03

分子量： 190000Da (2鏈)

防腐劑： 無，0.22µm過濾

存儲： - 7 0oC或以下。避免凍融。

根源 正常的人類血清 (經(jīng)認(rèn)證的HBsAg、HTLV-I/II、STS和HCV、 HIV1和HIV-II抗體檢測均為陰性) 。

預(yù)防措施 在處理人類血液制品時要采取常規(guī)的預(yù)防措施。

一般說明

天然人類C5是一種天然糖基化 (1.6%) 多肽，包含兩個二硫鍵鏈。C5對于膜攻 擊復(fù)合物 (MAC) 的形成是必不ke少的，并可被補(bǔ)體激活的所有三種途徑激活。補(bǔ)體 激活的每個途徑都產(chǎn)生蛋白水解酶復(fù)合物 (C3/C5轉(zhuǎn)化酶) ，它們與目標(biāo)表面結(jié)合   (Ross，G。D. (1986)).這些酶在C5的較大的阿爾法鏈中切割一個肽鍵，釋放高效的 過敏性毒素C5a (74個氨基酸) 并激活C5b。這是C5b-9復(fù)合物組裝過程中唯yi的蛋白 水解步驟。C5b是不穩(wěn)定的，但它仍然與激活復(fù)合物結(jié)合短暫的時間 (~2分鐘) ，在 此期間，它要么與周圍液體中的一個C6結(jié)合形成C5b，6，要么衰變并聚集，不再能夠 形成MAC。C5b，6復(fù)合物也可能繼續(xù)與C3/C5轉(zhuǎn)化酶結(jié)合，其中單個C7的結(jié)合暴露了一 個膜結(jié)合區(qū)域，而C5b，6,7可以部分插入靶細(xì)胞的膽脂層。到目前為止，該復(fù)合物可 能會從目標(biāo)細(xì)胞擴(kuò)散出去，進(jìn)入附近細(xì)胞的細(xì)胞膜。這被稱為旁觀者裂解或“反應(yīng)性 裂解" ，可以是一個重要的病理來源。每個C5b-7復(fù)合物都可以結(jié)合一個C8蛋白分子 ，從而使該復(fù)合物更牢固地插入到細(xì)胞膜中。這個復(fù)合物與C9結(jié)合，每個結(jié)合的C9可 以結(jié)合另一個C9，起始形成一個包含多達(dá)18個C9分子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(Podack，E。       R. (1984)).具有一個或多個C9的C5b-9復(fù)合物被稱為補(bǔ)體的膜攻擊復(fù)合物 (MAC) 。  并不是所有的C5b-8配合物都有完整的C9環(huán)，平均每個C5b-8配合物只有3個C9。C9的 完整的蛋白環(huán)形成了電子顯微鏡上看到的孔，它們導(dǎo)致代謝物和小蛋白質(zhì)泄漏出細(xì)胞 ，以及水進(jìn)入細(xì)胞。如果將足夠數(shù)量的水插入細(xì)胞膜，那么由于滲透壓，流入細(xì)胞的 水就會使細(xì)胞膜破裂，使目標(biāo)細(xì)胞 (或一個旁觀者細(xì)胞) 的全部內(nèi)容物被釋放出來。 任何一種過程都可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。最初人們認(rèn)為每個細(xì)胞只需要一個C5b-9復(fù)合物( 被稱為裂解的“一打擊理論"(隆美爾F。A.和梅耶爾，M.M. (1973) )，但這可能是不正確的。例如，一個紅細(xì)胞需要大約850個C5b-9 復(fù)合物，通過C7分子的數(shù)量來衡量，才能發(fā)生裂解(Bauer，J。以及其他人     (1979)).受CD59保護(hù)的抗MAC的宿主細(xì)胞需要足夠數(shù)量的C5b-9來捆綁所有的CD59 ，然后再捆綁大約850個C5b-9。有核細(xì)胞的裂解需要更多的C5b-9復(fù)合物，因為 它們的大小和在這些細(xì)胞中存在多種防御機(jī)制。

物理特性和結(jié)構(gòu)

分子量：  190,000 Da，由兩個二硫鍵連接鏈組成。阿爾法鏈?zhǔn)?115,000 Da ， 貝塔鏈?zhǔn)?5,000 Da 。阿爾法鏈和阿爾法鏈?zhǔn)峭ㄟ^一個二硫鍵連接起來的。C5 的 pI為4.7到5.5。

C3/C5轉(zhuǎn)化酶切割C5，從alpha鏈的n端釋放C5a ( 一個74個氨基酸片段，8268 Da去糖基化，10400+1000糖基化) 。C5b片段 (181,000 Da) 與C6結(jié)合，啟動膜攻擊 復(fù)合物的自發(fā)組裝。

CAS編號：80295-53-0

 測定

C5zui簡單的檢測方法是使用C5耗盡的人血清，并測量EA (經(jīng)典途徑) 或Er (替 代途徑) 的裂解，作為添加的測試樣品或標(biāo)準(zhǔn)純化C5濃度的函數(shù)。每個du特的應(yīng)用程 序都可能需要確定適當(dāng)?shù)臈l件。然而，一個典型的檢測方法包括在濕冰上混合25µL  C5-Dpl，含c5的樣品用GVB++稀釋到1到10 ng C5，以及足夠的GVB++使體積達(dá)到300µL 。EA (3 X 107最后加入200µL)。純化的C5或正常的人血清 (NHS) 可作為C5的來源。 將反應(yīng)混合物在37個條件下孵育30 mino加入C和1 mL的冷GVBE。然后混合反應(yīng)并離心 ，旋轉(zhuǎn)未裂解的細(xì)胞。然后在415 nm處分析上清液中釋放的血紅蛋白，并與不含C5的 空白細(xì)胞 (背景裂解對照) 和用275µL水代替GVB++和25µL C5-Dpl (100%裂解對照)  進(jìn)行比較。

許多其他的檢測方法已經(jīng)被描述為使用EA預(yù)加載C1 (EAC1細(xì)胞) 或預(yù)加載經(jīng)典 途徑C5轉(zhuǎn)化酶 (EAC1423細(xì)胞) 。然而，所有這些檢測方法都需要使用多種純化的補(bǔ) 體成分或更難以制備的試劑(Dodds，A。W.和Sim，R。B. (1997) ；摩根，B。P. (2 000)

參考文獻(xiàn)

Bauer, J., Podack, E.R. and Valet, G. (1979) Determination of the number of lytic sites in biconcave and spheroid erythrocyte ghosts after complement lysis. J. Immunol. 122:2032-2036.

Dodds, A.W. and Sim, R.B. editors (1997) Complement. A Practical Approach (ISBN 019963539) Oxford University Press, Oxford.